猪外周血NK细胞分离液

产品货号：

JH0012

中文名称：

猪外周血NK细胞分离液

英文名称：

Pig peripheral blood NK cells separation solution

产品规格：

2×200mL

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

保存：常温，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

实验前准备：

适用仪器
最大离心力可达1200g的水平转子离心机
抗凝剂的选择
在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验。为此，我公司特别推出抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。
名称货号规格
细胞分离专用抗凝剂 JH0810 100mL/200mL/500mL
实验动物一次性负压采血管(5mL) JH0806 100支/包
无菌硅化离心管
名称货号规格
无菌硅化离心管(10mL) JH0803 100支/包

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。

方法一（需留取血浆备用）

首先取抗凝血250g离心10min，弃血浆，补加胎牛血清（添加量与弃去血浆量等同）制成细胞悬液，根据细胞悬液液体体积，选择适当离心管进行试验。
取一支离心管，依次小心加入分离液1、分离液2（体积比为3:1，试剂总量与细胞悬液体积比为2:1。如细胞悬液为2mL，则先后加入3mL分离液1、1mL分离液2。试剂总量最少不低于4mL。），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液液面上，400～500g，离心20～30min。
注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。
离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色NK细胞层（第一层白环及上层50%分离液2）。第三层为环状乳白色单个核细胞层（下层50%分离液2及第二层白环）。第四层为透明分离液1液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞层。
用吸管小心吸取第二层到另一15mL离心管中，向所得离心管中加入10mL清洗液（货号：JH0801），混匀细胞。
250g，离心10min。
弃上清。
用吸管以5mL清洗液（货号：JH0801）重悬所得细胞。
250g，离心10min。
重复6、7、8，弃上清后以0.5mL后续实验所需相应液体重悬细胞。

方法二（不需血浆留存备用）

根据新鲜抗凝全血样本量选取一支离心管，依次小心加入分离液1、分离液2（体积比为3:1，试剂总量与抗凝血体积比为2:1。如抗凝血为2mL，则先后加入3mL分离液1、1mL分离液2。试剂总量最低不低于4mL。），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
用吸管小心吸取抗凝血加于分离液液面上，400～500g，离心20～30min。
注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。
离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色NK细胞层（第一层白环及上层50%分离液2）。第三层为环状乳白色单个核细胞层（下层50%分离液2及第二层白环）。第四层为透明分离液1液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞层。
后续步骤同方法一。

差异贴壁法纯化细胞：

用NK细胞无血清培养基或NK细胞完全培养基以1.5～3×10⁶个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
2～4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
10～24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
不贴壁的为淋巴细胞。

注：

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取血2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
吸取过多的目的细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

参考值（参考范围）：
本实验NK细胞提取率大于80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

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